K8·凯发(中国)

针对上述问题，研究团队开发了一种基于仿生肽修饰脂质纳米颗粒的喷雾式水凝胶系统。定制的两种肽分别为血小板粘附肽（PAP，序列：GFOGER）和血小板交联肽（PCP，序列：GGQQLK），顺利获得酰胺键连接到DSPE-PEG2000-COOH上，形成DSPE-PEG-PAP和DSPE-PEG-PCP。这些化合物与二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇以及二硬脂酰磷脂酰丝氨酸混合，顺利获得薄膜水化法构建出肽修饰的脂质纳米颗粒，随后被纳入由CaCl₂和藻酸钠构成的离子交联喷雾式水凝胶中。实验结果表明，该水凝胶在肝脏出血模型中30秒内迅速凝胶化并密封伤口。PAP激活并黏附血小板，DSPS和Ca²⁺放大凝血酶原激活，PCP强化纤维蛋白网络，共同促进快速止血。该喷雾式水凝胶在管理非压缩性出血方面具有显著潜力，为未来临床应用给予了新策略。该文章以《A Sprayable Hydrogel Based on Biomimetic Polypeptide-Modified Lipid Nanoparticles for Treating Non-Compressible Hemorrhaging》为题发表于《Advanced Materials》（DOI: 10.1002/adma.202500908）。

研究示意图

（1）多肽修饰脂质纳米粒（PLNs）可喷雾水凝胶的设计与表征

图1a展示了血小板粘附肽（PAP）和血小板交联肽（PCP）分别顺利获得酰胺键连接到DSPE-PEG2000-COOH载体上的合成过程。图1b顺利获得MALDI-TOF质谱分析确认了两种脂肽偶联物的成功合成，DSPE-PEG2000-PAP的质量为2732.31 Da，DSPE-PEG2000-PCP的质量为2684.31 Da。图1c是PLNs制造过程的示意图，利用薄膜水化法将胆固醇、DSPC、DSPS、DSPE-PEG-PCP和DSPE-PEG-PAP自组装成异多价肽修饰的纳米颗粒。图1d显示PLNs的ζ电位数据，表明其表面带有负电荷。图1e的动态光散射显示PLNs的平均粒径约为100 nm，图1f的透射电子显微镜图像证实了这一尺寸分布，且颗粒形态良好且均匀。

图1 多肽修饰脂质纳米粒的设计和表征。（a）两种脂肽缀合物的合成；（b）两种脂肽缀合物的MALDI-TOF MS（Th：理论质量）；（c）使用薄膜水合制备胆固醇、DSPC、DSPS、DSPE-PEG-PCP和DSPE-PEG-PAP以自组装成杂多价多肽修饰的纳米颗粒的PLN的制备示意图（DSPC，二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；DSPE，1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N [甲氧基]；DSPS，二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸-L丝氨酸；PCP，血小板交联肽；PAP，血小板粘附肽）；（d）PLN的Zeta电位；（e）顺利获得动态光散射检测的PLN的尺寸分布；（f）PLN的透射电子显微镜图像，比例尺=100 nm

图2展示了PLNs与不同成分结合后的性能评估。图2a证明了PLNs在Ca²⁺存在下具有快速凝胶化的特性。图2b和2c顺利获得流式细胞术测量了富含血小板血浆（PRP）与不同样品共孵育后CD62P阳性血小板比率的变化，结果显示PLNs能够显著促进血小板活化。图2d的荧光图像进一步证实了PLNs对血小板的黏附作用。图2e展示了PLNs喷雾式水凝胶在大鼠肝脏切口模型中的止血效果，表明其相比传统止血材料具有更好的止血效能，减少了出血量并缩短了止血时间。

图2 PLN/凝胶的制备和表征。（a）PLN/凝胶的设计和照片；（b）PLN/凝胶的原位止血照片；（c）不同凝胶浓度的凝血指数；（d）凝胶和PLN/凝胶的孔隙率和（e）溶胀比（ns=不显著；*p<0.05，*p<0.001，每组n=3）

（2）PLNs可喷雾水凝胶的生物相容性和降解性

图3a显示水凝胶对红细胞的溶血率均低于5%，无毒性。图3b表明水凝胶处理组的LDH释放量与PBS对照组相似，对血小板无显著毒性。图3c和3d显示人脐静脉内皮细胞与水凝胶共培养后，细胞活力超过95%，形态正常，AO/EB染色几乎无死细胞，证明水凝胶的细胞相容性。图3e显示14天时Gel组降解率为63.74±2.78%，PLNs/Gel组为71.44±6.74%，有良好体外降解行为。图3f和g显示将Gel和PLNs/Gel应用于大鼠肝脏表面损伤部位后，14天组织学分析发现周围组织无显著病理反应，各器官也无明显变化，确认其良好组织相容性。图3h和3i显示植入材料后SD大鼠全血功能、肝肾功能等指标均正常，说明植入材料对主要代谢器官功能无不利影响。

图3 PLNs/Gel的体外和体内生物相容性。（a）PLN、凝胶和PLN/凝胶组的照片和溶血率，PBS和Triton X-100分别用作阴性和阳性对照；（b）与PLN、凝胶或PLN/凝胶孵育2小时后，指示血小板毒性的LDH活性；（c）人脐静脉内皮细胞（HUVEC）在与培养基、PLN、凝胶和PLN/凝胶提取物温育24和48小时后的细胞存活率；（d）用PLN/凝胶提取物孵育后HUVEC的代表性活/死染色图像；（e）在PBS中溶菌酶对凝胶和PLN/凝胶的体外降解曲线；（f）水凝胶植入大鼠肝脏的实验方案；（g）在肝脏中植入水凝胶7天和14天后，心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的代表性H&E图像；（h）全血细胞计数和（i）皮下植入凝胶和PLN/凝胶后14天的Sprague道利大鼠的血液生化分析（WBC，白细胞；Lym#，淋巴细胞；RBC，红细胞；HGB，血红蛋白；HCT，红细胞压积；PLT，血小板；ALT，丙氨酸转氨酶；AST，天冬氨酸转氨酶；ALP，碱性磷酸酶；ALB，白蛋白；CR，肌酐；GGT，γ-谷氨酰转移酶；ns=不显著；*p<0.05，**p<0.01，*p<0.001，每组n=3）

（3）PLN与血小板相互作用以改善体外凝块形成

图4a展示了血小板顺利获得不同成分刺激形成稳定血凝块的过程示意图。图4b显示在新鲜抽取的血液样本中，CD62P阳性血小板比例为0.33±0.15%。阳性对照组中，ADP激动剂使93.27±0.74%的血小板被激活。图4c显示PLNs处理组中CD62P阳性血小板比例显著高于DSPS、PCP和PAP处理组（分别为89.07±0.5% vs 66.57±0.81%、64.9±0.66%和68.9±0.78%，p<0.001），表明PLNs可协同诱导血小板活化。图4d展示了PLNs与天然静息血小板相互作用的显微镜图像，PLNs（绿色荧光）与血小板表面结合并激活P-选择素抗体（红色荧光），显示出双荧光，表明PLNs可以结合并激活天然静息状态的血小板。

图4 PLN和血小板之间的相互作用。（a）PLN机制示意图；（b、c）流式细胞仪检测不同样品（NC：富血小板血浆；PC：ADP血小板激动剂，终浓度为10 μM）培养的富血小板血浆（PRP）中CD62P阳性血小板率；（d）与PLN共孵育后血小板的荧光图像（绿色：PLN；红色：PE-CD62P，表明血小板活化）（ns=不显著；*p<0.05，**p<0.01，*p<0.001，每组n=3）

图5展示了PLNs参与凝血级联反应的过程及其效果。图5a概述了血小板在凝血级联反应中的作用。图5b至5d显示PLNs处理组的APTT、TT和PT均显著缩短，表明PLNs能加速凝血过程。图5e显示PLNs处理组纤维蛋白凝块的吸光度增加，验证了PLNs对凝块形成的促进作用。图5f展示了将修饰纳米颗粒注射到大鼠尾静脉出血模型中的实验设计。图5g和5h显示PLNs处理组的出血量显著减少且止血时间明显缩短。图5i显示PLNs显著增加激活血小板的聚集率，促进止血并减少血栓风险。

图5 PLN参与凝血级联反应。（a）血小板参与凝血级联反应；（b）治疗后贫血小板血浆（PPP）中活化部分凝血活酶时间（APTT）的分析；（c）凝血酶时间（TT）的分析；（d）凝血酶原时间（PT）的分析；（e）形成的纤维蛋白凝块吸光度；（f）在大鼠尾部横切出血模型中，将修饰的纳米颗粒注射到尾静脉中；（g）处理30 min后，顺利获得切断尾部测量失血量；（h）止血时间；（i）血小板聚集率（ns=不显著；*p<0.05，**p<0.01，*p<0.001，每组n=3）

（4）PLNs可喷雾水凝胶对红细胞和血小板的粘附作用

图6a显示喷雾水凝胶与全血共孵育后约30秒内形成稳定血凝块，凝血速度显著优于纱布和明胶海绵等传统止血材料。血液凝固指数（BCI）测定证实其优异凝血效能，BCI值越低止血效果越显著。喷雾水凝胶接触血液后迅速形成胶体网络，覆盖伤口物理性阻止血细胞流失，负电荷海藻酸盐材料吸附多种血液蛋白增强血细胞聚集，PLNs加速伤口处血小板激活触发凝血级联反应，钙离子激活凝血过程促使血细胞快速聚集。图6b和c定量分析不同材料表面的红细胞和血小板粘附率，PLNs/Gel组红细胞粘附率为92.66±3.85%，血小板粘附率为91.05±4.61%，显著高于Gel组和其他对照组，证实PLNs喷雾水凝胶能有效增强血细胞粘附能力促进凝血过程。图6d和e顺利获得SEM观察材料表面红细胞和血小板粘附情况，Gel和PLNs/Gel组表面有大量聚集的红细胞和血小板，PLNs/Gel组血小板展现明显伪足延伸，表明血小板被激活，而纱布和明胶海绵对照组仅吸附少量血细胞，进一步证实喷雾水凝胶对血细胞聚集的促进作用。图6f为PLNs喷雾水凝胶在大鼠肝脏出血模型中止血的示意图，描绘其在肝脏出血部位形成紧密物理屏障迅速阻止血液流失。图6g的SEM图像展示喷雾水凝胶在肝脏出血部位的应用效果，快速凝胶网络在伤口处形成致密物理屏障固定大量红细胞，聚集红细胞形态由双凹圆盘状变为不规则形状，因PLNs加速血小板激活导致血小板收缩应力引发纤维蛋白网络收缩，PLNs表面多价修饰增强血小板和纤维蛋白间凝块形成，减小附着纤维蛋白丝间角度促使网络收缩，伤口处快速凝胶化使红细胞紧密关联，共同促进聚集红细胞形态变化。

图6 PLN/凝胶诱导的体外凝血。（a）空白组、纱布组、GS组、凝胶组和PLN/凝胶组的时间依赖性凝血行为和BCI值；（b）纱布、GS、凝胶和PLN/凝胶组中RBC粘附百分比的定量分析；（c）血小板粘附百分比的定量分析；（d）RBC粘附的代表性SEM图像；（e）血小板粘附的代表性SEM图像，还显示了矩形区域的高倍放大图像（白色箭头：红细胞或血小板；红色箭头：活化的血小板）；（f）观察区的示意图；（g）肝出血部位的SEM图像（ns=不显著；*p<0.05，*p<0.001，每组n=3）

（5）PLNs可喷雾水凝胶的止血性能

图7a展示了大鼠肝脏切口模型的示意图，肝脏表面制造5毫米切口模拟急性出血，观察不同材料止血效果。图7b显示不同材料处理后止血效果，PLNs/Gel组出血明显减少，凝血速度快，止血效果优于其他组。图7c展示了PLNs的结构和作用机制，PAP和PCP分别激活和粘附血小板，DSPS和Ca²⁺放大凝血酶激活过程，PCP与纤维蛋白交联形成稳定凝血块。图7d和e定量分析了不同处理组的失血量和止血时间，PLNs/Gel组失血量为0.44±0.08克，止血时间为29.48±2.83秒，均显著优于其他组。实验表明PLNs喷雾水凝胶顺利获得模拟凝血机制，快速形成稳定凝血块，提升止血效率，具有处理复杂伤口和内部器官伤口的潜力。

图7 大鼠模型中PLN/Gel的体内止血功效。（a）大鼠肝脏切开模型的图示；（b）纱布、GS、凝胶和PLN/凝胶在大鼠肝脏切口模型中的止血效果；（c）多肽修饰脂质纳米粒的设计与机理；（d）大鼠肝脏切开模型中的失血量；（e）止血时间（ns=不显著；*p<0.05，*p<0.001，每组n=3）