K8·凯发(中国)

针对上述问题，复旦大学附属口腔医院刘月华/高隽团队利用共病小鼠模型整合行为学评估、功能磁共振成像（fMRI）和分子生物学检测，阐明了牙周致病菌来源的外膜囊泡（PgO）顺利获得激活HIF-1α/HMGB1/NLRP3信号轴加重IH诱导的海马神经元损伤的分子机制；并基于该机制设计了一种非对称的RVG-Au&mSiO₂-TPP-VB Janus纳米制剂，实现"神经元—线粒体"层级靶向递送。该文章于2026年7月7日以《Mechanism-Driven Nanoformulations for Cognitive Impairment Induced by Intermittent Hypoxia and Periodontitis》为题发表于《Advanced Materials》（DOI：10.1002/adma.73920）。

图1. PgO加重IH诱导的认知障碍及其被层级神经元-线粒体靶向Janus纳米制剂缓解的示意图。

（1）PgO加速IH诱导的认知功能障碍

PgO自标准Pg菌株（ATCC33277）培养上清中分离纯化。TEM与NTA表征确认其为粒径均一的球形囊泡，平均直径约67.7 nm（图2A、B）。为评估牙周炎与认知障碍的共病关系，在已建立的IH模型基础上联合PgO干预（图2C）。建模4周后，单独IH即诱导显著的牙槽骨吸收和附着丧失，PgO与IH联合暴露（IP组）进一步加重牙周破坏，形成所有组中最严重的牙周表型（图2D–G）。

行为学评估显示，旷场实验中各组小鼠运动能力及焦虑样行为均无显著差异（图2H、I），排除活动或焦虑改变对后续认知测试的干扰。Y迷宫测试中，单独IH或单独PgO均未引起显著认知损伤，而联合暴露（IP组）小鼠表现出明显认知功能下降（图2J、K）。时序干预实验表明，4周既有IH后引入PgO（IH-IP组）2周内即导致显著认知损伤，反向时序（PgO-IP组）未产生同等缺陷（图2L），提示既有IH使大脑对PgO介导的损伤敏感化。

全脑c-Fos染色显示，急性IH暴露3天后神经元激活以海马区最为显著，尤以CA1亚区突出（图2M–O）。以海马CA1为种子点的fMRI体素水平功能连接分析显示，与Sham组相比，IP组全脑功能连接显著降低（图2P）；基于CA1活动选取的8个脑区的相关性矩阵亦显示Sham组的显著相关在IP组中削弱（图2Q、R）。

图2. PgO作为病理加速因子，显著加快IH诱导的认知衰退的发生和进展。（A）PgO的TEM和（B）NTA表征（比例尺：20 nm）。（C）小鼠模型建立的实验时间线示意图。（D、E）建模4周后小鼠牙槽骨的Micro-CT和（F、G）H&E染色（n = 5；比例尺：500 μm）。（H、I）旷场实验中的运动活动能力。（J）Y迷宫装置示意图。（K、L）Y迷宫实验中的自发交替表现（n = 7）。（M）组织透明化和成像后Sham和IH小鼠不同脑区的c-Fos表达。（N）海马区c-Fos表达热图。（O）不同脑区c-Fos表达热图（n = 3）。（P）基于静息态fMRI数据对CA1进行基于种子的功能连接分析。Sham组与IP组之间具有显著组间差异的体素投射到标准脑模板上。红色：Sham组连接强于IP组的体素。蓝色：Sham组连接弱于IP组的体素。（Q）用于分析的8个种子脑区的三维示意图。（R）Sham组和IP组平均相关系数（r值）的相关矩阵（n = 5）。

（2）PgO加剧IH下的氧化应激与炎症，加速神经元和线粒体损伤

建模4周终点，对IH与牙周炎共病诱导的脑损伤进行组织学评估。DHE染色显示，与IH组相比，IP组海马CA1区ROS显著增加（图3A、B）。海马组织及血清ELISA检测表明，单独IH或单独PgO暴露均可升高TNF-α、IL-1β、IL-18和HMGB1水平，联合处理（IP组）引起这些炎症因子最显著的上调（图3C–F）。IBA1免疫染色显示，IP组CA1区小胶质细胞密度更高，胞体增大、突起缩短并呈阿米巴样形态，符合激活特征（图3G–I），并伴反应性星形胶质细胞增生，提示海马处于炎症与应激状态。

神经元完整性在IP组受损最为严重。NeuN染色显示CA1神经元进行性丢失，由单独IH小鼠的轻度丢失开展至IP组动物的广泛丢失（图3J、K）。γH2A.X阳性神经元细胞核显著增加，表明基因组不稳定及DNA双链断裂累积（图3L）。TEM超微结构分析给予直接的病理学证据：IP组海马线粒体异常最为严重，包括嵴溶解和空泡样变性（图3M、N）。

图3. PgO在IH背景下加剧海马氧化应激和神经炎症，驱动CA1区线粒体损伤加速和神经元丢失。（A、B）建模4周后小鼠海马CA1区DHE免疫荧光染色的代表性图像（n = 5；比例尺：50 μm）。（C–F）小鼠海马炎症细胞因子的ELISA定量（n = 6）。（G–I）小鼠CA1海马区IBA1免疫荧光代表性图像及小胶质细胞形态的定量分析，包括胞体面积和分支数量（n = 5；比例尺：20、5 μm）。（J、K）小鼠海马CA1区NeuN和γH2A.X的免疫荧光染色（n = 5；比例尺：50 μm）。（M、N）小鼠海马神经元线粒体的TEM图像（n = 5；比例尺：250、100 nm）。

（3）PgO顺利获得HIF-1α/HMGB1/NLRP3通路增强IH诱导的海马损伤

为阐明PgO加重IH诱导认知损伤的机制，对小鼠海马组织进行bulk RNA测序。差异表达基因的GO富集分析显示免疫细胞激活过程显著富集，包括白细胞趋化和巨噬细胞迁移；KEGG通路分析证实趋化因子/细胞因子信号及神经活性配体-受体相互作用通路显著富集（图4A、B）。单基因富集分析显示，NLRP3特异性关联DNA损伤修复和氧化磷酸化通路，而非一般炎症通路（图4C）；相关性分析证实HIF-1α/HMGB1/NLRP3通路组分、TLR4与焦亡相关基因（Gsdmd、Casp1）之间存在密切关联（图4D）。

与此一致，建模4周后，IP组海马裂解液中HIF-1α、NLRP3及关键焦亡标志物的表达较单独IH组进一步升高，mRNA水平呈相应变化（图4E–M）。上述结果确立HIF-1α/HMGB1/NLRP3信号轴为PgO加剧IH诱导海马神经元损伤的关键机制。

图4. PgO顺利获得激活HIF-1α/HMGB1/NLRP3轴加重IH诱导的海马损伤，该轴整合氧化应激与炎症小体驱动的焦亡以加速神经元损伤。（A）Sham组和IP组小鼠海马组织的GO功能富集分析。（B）Sham组和IP组小鼠海马组织的KEGG通路富集分析。（C）NLRP3的单基因富集分析。（D）HIF-1α、NLRP3、HMGB1、TLR4及焦亡相关基因的相关性热图。（E–J）建模4周后小鼠海马组织的蛋白质印迹分析和（K–M）RT-qPCR分析（n = 3）。

（4）PgO促进IH条件下HT22细胞中HIF-1α/HMGB1/NLRP3通路的激活

为在排除全身因素的情况下剖析神经元内在的炎症机制，采用小鼠海马神经元细胞系HT22进行研究。CCK-8实验确定5 μg mL⁻¹的PgO不影响细胞活力，用于后续实验。IH条件下HT22细胞增殖在3天后受到显著抑制，加入PgO（5 μg mL⁻¹）使这一抑制效应提前至2天出现。PKH-26标记的PgO在IH暴露1 h和3 h后进入HT22细胞增多（图5A–C）；IH+PgO联合处理12 h后，细胞内及线粒体ROS水平均显著升高（图5D）。蛋白质印迹分析显示，与单独IH相比，体外IP组（IH+PgO共暴露）HIF-1α上调，NLRP3、TLR4、N-GSDMD和cleaved caspase-1蛋白水平升高，伴Hif1α、Nlrp3、Tlr4 mRNA表达增加及HMGB1分泌增多（图5E–K）。

siRNA敲低HIF-1α后，IP组NLRP3、TLR4、N-GSDMD和cleaved caspase-1蛋白水平显著降低，细胞外HMGB1释放受抑制，γH2A.X染色所示DNA损伤减轻；使用NLRP3激动剂尼日利亚菌素处理IP组细胞则进一步增强上述介质的表达并加剧DNA损伤（图5L–S）。上述结果证明PgO顺利获得HIF-1α/HMGB1/NLRP3通路增强IH诱导的氧化应激并促进炎症激活，且HIF-1α位于NLRP3上游介导这一促炎细胞损伤。

图5. PgO顺利获得激活HIF-1α/HMGB1/NLRP3通路，加速HT22细胞中IH诱导的氧化应激和炎症损伤。（A–C）与PKH-26标记的PgO（红色）共培养1 h和3 h后HT22细胞的共聚焦显微镜图像，显示PgO的细胞内化（n = 4；比例尺：10 μm）。（D）处理后12 h顺利获得DCFH-DA染色流式细胞术检测细胞内ROS水平。处理后48 h，（E–J）使用细胞裂解液进行蛋白质印迹的蛋白表达谱分析。（K）细胞培养上清液中HMGB1浓度的ELISA测定。对IP组细胞进行HIF-1α siRNA转染敲低和尼日利亚菌素刺激后，（L–Q）使用细胞裂解液检测蛋白表达。（R）细胞培养上清液中HMGB1浓度的ELISA测定。（S）建模及用HIF-1α siRNA转染和尼日利亚菌素处理IP组细胞后γH2A.X的代表性免疫荧光图像（n = 3；比例尺：100 μm）。

（5）线粒体靶向Janus纳米制剂减轻HT22细胞氧化损伤

基于线粒体ROS在共病小鼠模型神经元损伤中的核心作用，构建了层级靶向Janus纳米制剂RVG-Au&mSiO₂-TPP-VB。该结构顺利获得各向异性岛状成核生长策略在Au纳米颗粒一侧选择性沉积mSiO₂制备：Au隔室选择性功能化连接神经元靶向肽RVG（Au–S键），mSiO₂隔室共价连接线粒体靶向配体TPP（酰胺键），抗氧化剂维生素B2（VB）负载于介孔通道内（图6A）。

SEM和TEM图像显示该Janus纳米结构形貌规整、粒径均一、分散性良好（图6B、C）。HAADF-STEM及EDS元素映射确认Au和Si在Au&mSiO₂纳米结构相对半球上空间分离分布，Si/Au原子比约5:3（图6D）。氮气吸附-脱附测试显示BET比表面积约71.9 m² g⁻¹、BJH孔径约2 nm，表明mSiO₂隔室内介孔通道发育良好（图6E）。水动力学粒径、ζ电位及FTIR特征性变化证实RVG和TPP在Janus纳米颗粒上非对称表面修饰成功（图6F、G）。纳米载体对核黄素磷酸钠的负载能力为9.45 μg mg⁻¹，体外释放研究显示约60%药物载荷在前3 h内释放（图6H）；圆二色谱证实RVG29在制备条件下构象稳定。

CCK-8实验显示该纳米制剂在100 μg mL⁻¹浓度以下对HT22细胞无明显细胞毒性。流式细胞术检测显示20 μg mL⁻¹的RVG-Au&mSiO₂-TPP-VB显著降低细胞内ROS水平（图6I），该浓度用于后续实验。共定位实验证实，仅含TPP的Janus结构组出现明显的线粒体共定位，凸显Janus结构和TPP在线粒体靶向中的关键作用。MitoSOX染色显示，RVG-Au&mSiO₂-TPP-VB显著抑制线粒体ROS水平，优于非靶向纳米颗粒和游离VB（图6J、L）；共培养48 h后，γH2A.X染色表明该纳米制剂较其他所有组对HT22细胞氧化性DNA损伤给予更优保护（图6K、M）。

图6. 层级靶向Janus纳米制剂的设计、表征及线粒体抗氧化功能。（A）层级神经元-线粒体靶向Janus纳米制剂构建及VB负载于介孔通道的示意图。（B、C）TEM和SEM图像显示纳米制剂具有形貌明确的Janus纳米结构，粒径均一、分散性良好（比例尺：100、50 nm）。（D）Janus纳米制剂的HAADF-STEM图像及相应EDS元素映射，确认Au和Si分布的空间分离（比例尺：50 nm）。（E）Au&mSiO₂纳米颗粒的N₂吸附-脱附等温线和BJH孔径分布。（F）逐步表面功能化后Au&mSiO₂纳米颗粒的水动力学粒径。（G）证实RVG和TPP成功偶联的FTIR光谱。（H）Janus RVG-Au&mSiO₂-TPP-VB纳米制剂中VB的体外释放曲线（n = 3）。（I）流式细胞术分析经不同浓度RVG-Au&mSiO₂-TPP-VB处理的HT22细胞内ROS水平。（J、K）不同处理后HT22细胞线粒体ROS水平（MitoSOX强度）和DNA损伤（γH2A.X强度）的定量（n = 3）。（L）共聚焦显微镜图像显示HT22细胞中PKH26标记纳米颗粒的线粒体共定位（比例尺：10、5 μm）。（M）免疫荧光染色显示，与其他组相比，经Janus RVG-Au&mSiO₂-TPP-VB纳米制剂处理的HT22细胞氧化性DNA损伤减少（比例尺：100 μm）。

（6）神经元靶向Janus纳米制剂改善IP模型小鼠认知功能障碍

除常规静脉给药外，采用鼻腔给药评估RVG-Au&mSiO₂-TPP-VB Janus纳米制剂的脑靶向效率。鼻腔给药后，DiD标记的Janus纳米制剂在2 h内迅速入脑，且2、12和24 h时的脑蓄积水平显著高于静脉给药（图7A–C）。相比之下，静脉注射导致大量肝脏蓄积，鼻腔给药则显著减少肝脏沉积，仅肺部蓄积略有增加。给药后24 h内鼻腔黏膜基底层持续存在强荧光信号，提示鼻腔滞留延长及可持续的入脑递送。全脑荧光成像显示纳米制剂在脑内广泛分布；免疫荧光进一步证实纳米制剂主要与海马CA1神经元（NeuN）共定位，与小胶质细胞（IBA1）和星形胶质细胞（GFAP）共定位极少，表现出高度的体内选择性（图7D、E）。

在IP模型小鼠中评价治疗效果，分组包括鼻腔给药组（J-NAS）、静脉给药组（J-IV）、鼻腔游离VB组、未负载RVG-Au&mSiO₂-TPP组、生理盐水组（Ctrl）及静脉注射HIF-1α抑制剂LW6组（用于验证HIF-1α的核心作用并给予机制明确的疗效基准）。治疗4周后，各组运动能力和焦虑样行为无显著差异（图7F、G）；Y迷宫和恐惧条件化测试显示，Janus纳米制剂处理显著改善认知功能，其中鼻腔给药疗效优于或相当于静脉给药（图7H、I）。fMRI分析显示，与IP组相比，J-NAS和J-IV组海马CA1种子点与全脑体素间的功能连接显著增强，且鼻腔给药组表现出更广泛的体素水平连接和更强的CA1-全脑整合（图7J、K）。组织病理学评估证实纳米制剂的生物安全性：鼻腔给药后鼻间隔和鼻甲黏膜完整，各治疗组主要器官未见明显病理异常。

图7. 鼻腔递送Janus纳米制剂增强脑蓄积并改善IP模型小鼠的认知功能障碍。（A）鼻腔/静脉给药后不同时间点DiD标记Janus纳米制剂的体内分布和（B、C）脑部荧光成像（n = 3）。（D）鼻腔给药DiD标记Janus纳米制剂（红色）后鼻组织切片的代表性荧光图像（不同放大倍数）。（E）鼻腔给药DiD标记Janus纳米制剂24 h后，与海马CA1神经元（NeuN）、小胶质细胞（IBA1）和星形胶质细胞（GFAP）共定位特异性的共聚焦显微镜图像（n = 3；比例尺：100、50、20、10 μm）。干预后的行为学测试：（F）旷场总运动距离，（G）旷场中心停留时间，（H）Y迷宫交替指数，（I）恐惧条件化情境冻结时间（n = 7）。（J）基于静息态fMRI数据对CA1进行基于种子的功能连接分析。J-NAS组与J-IV组之间具有显著组间差异的体素投射到标准脑模板上。红色：J-NAS组连接强于J-IV组的体素。蓝色：J-NAS组连接弱于J-IV组的体素。（K）J-NAS和J-IV组CA1中心功能连接矩阵热图（n = 5）。

（7）Janus纳米制剂缓解海马CA1区氧化应激、线粒体功能障碍和焦亡

进一步的DHE免疫荧光染色和ELISA分析表明，LW6、鼻腔给药的Janus纳米制剂（J-NAS）和静脉给药的Janus纳米制剂（J-IV）均显著降低海马CA1区氧化应激，并降低海马组织和血清中TNF-α、IL-1β、IL-18和HMGB1等炎症因子水平，其中鼻腔递送的抗炎和抗氧化效力优于静脉给药（图8A–D）。IBA1免疫荧光染色显示，LW6和J-NAS均抑制CA1区小胶质细胞激活和反应性星形胶质细胞增生（图8E–G）。TEM成像显示，LW6和J-NAS治疗后线粒体超微结构显著恢复，线粒体数量增加、嵴形态保存良好（图8H、J）。此外，停止鼻腔给药后，脑内Au含量由治疗结束后第0天的70.73 mg/kg降至第14天的0.31 mg/kg，与未处理对照组无显著差异，提示Au在给药停止后2周内基本从脑内清除。

蛋白质印迹分析显示，LW6对HIF-1α的药理学抑制显著下调TLR4、NLRP3、N-GSDMD和cleaved caspase-1的表达；J-IV亦部分降低海马中HIF-1α及其下游焦亡相关蛋白的表达，但整体抑制效果不及J-NAS组（图8I、K–O）。NeuN和γH2A.X免疫荧光染色表明，LW6和J-NAS均有效减轻海马CA1亚区神经元DNA损伤，其神经保护作用显著强于J-IV，而鼻腔游离VB和未负载Janus纳米颗粒的神经保护作用有限（图8P–R）。

图8. 神经元-线粒体靶向Janus纳米制剂减轻海马CA1区的氧化应激、线粒体功能障碍和焦亡。（A–D）不同处理后海马组织中TNF-α、IL-1β、IL-18和HMGB1水平的ELISA定量（n = 6）。（E）CA1区不同处理后IBA1阳性小胶质细胞的代表性免疫荧光图像及相应的二值化骨架分析（比例尺：20、5 μm）。（F、G）小胶质细胞形态定量，包括胞体面积和分支数量（n = 5）。（H）TEM图像显示CA1神经元中的线粒体结构（比例尺：250、100 nm）。（I）海马组织中HIF-1α、TLR4、NLRP3、N-GSDMD和cleaved caspase-1表达的蛋白质印迹代表性图像。（J–O）受损线粒体的定量分析（n = 5）和相对蛋白表达水平（n = 3）。（P、Q）CA1亚区NeuN阳性神经元和γH2A.X荧光强度的定量（n = 5）。（R）各处理组海马CA1区NeuN和γH2A.X染色的代表性免疫荧光图像（比例尺：50 μm）。