K8·凯发(中国)

针对上述问题，山东大学齐鲁医院于德新教授、崔基炜教授、高志良教授与北京理工大学杨晓青教授团队开发了一种透明质酸（HA）修饰、负载Wnt/β-catenin抑制剂LF3的铜/锰-酚醛纳米胶囊（HLCM@Cap），实现pH响应释放、肿瘤靶向铜递送以及代谢与信号通路的协同调控。多酚介导的Cu²⁺部分还原为毒性更强的Cu⁺，诱导线粒体铜过载以放大铜死亡；LF3抑制Wnt/β-catenin通路，抑制糖酵解并阻断铜外排，对抗关键抵抗机制；释放的损伤mtDNA与Mn²⁺（强效STING激动剂）协同增强cGAS-STING激活，形成正反馈环路。同时，Mn²⁺赋予T1加权磁共振（MR）成像能力，可实时可视化肿瘤内纳米胶囊蓄积与释放，为优化给药时间窗给予指导。该文章于2026年6月24日以《Metal-phenolic nanocapsules enable a self-amplifying cuproptosis-STING cascade for synergistic cancer immunotherapy》为题发表于《Bioactive Materials》（DOI：10.1016/j.bioactmat.2026.06.013）。

方案1. HLCM@Cap的制备及其协同抗肿瘤免疫治疗机制示意图。

（1）金属-酚醛纳米胶囊的制备与表征

金属-酚醛纳米胶囊以ZIF-8为牺牲模板，顺利获得金属离子与多酚化合物之间的配位作用驱动形成（图1a-c）。LF3顺利获得π-π堆积、阳离子-π相互作用和氢键等非共价作用负载于CM@Cap中，得到LCM@Cap（图1b）。TEM确认纳米胶囊的中空结构，元素 mapping显示Cu、Mn、O、C、S、N分布良好匹配，其中S和N信号证实LF3成功负载（图1d）。动态光散射（DLS）测得Mn@Cap、Cu@Cap、LC@Cap、LCM@Cap和HLCM@Cap的水动力尺寸分别为165.2、231.2、201.3、186.3和183.1 nm，多分散指数（PDI）均低于0.20（图1e）；ζ电位分析显示所有胶囊均带负表面电荷（图1f），且在水中、5%葡萄糖及含血清培养基中具有良好的胶体稳定性。XPS分析证实：Cu 2p谱在934.35 eV（Cu 2p3/2）和954.3 eV（Cu 2p1/2）处出现特征峰，且峰形表明Cu²⁺部分还原为Cu⁺，有利于诱导铜死亡（图1g）；Mn 2p谱在641.40 eV和652.9 eV处的特征峰证实Mn²⁺存在（图1h）；S 2p峰（162.0 eV和163.55 eV）进一步证实LF3成功负载（图1i）。释放实验显示，pH 5.5条件下36 h内Cu²⁺释放约64.8%（pH 7.4时不足30%），Mn²⁺累积释放达42.4%（显著高于pH 7.4时的12.7%），证实了金属-酚醛纳米胶囊的pH响应性（图1j）。

图1. 金属-酚醛纳米胶囊的制备与表征。a) LF3的化学结构。b) LF3负载的驱动力，包括π-π堆积、阳离子-π相互作用和氢键。c) LCM@Cap和HLCM@Cap的TEM图像及相应的粒径统计分布，比例尺：100 nm。d) LCM@Cap的TEM元素 mapping，比例尺：100 nm。e) ZIF-8、Mn@Cap、Cu@Cap、LC@Cap、LCM@Cap和HLCM@Cap的体外粒径分布。f) 上述材料的ζ电位。g-i) LCM@Cap的Cu 2p g)、Mn 2p h)和S 2p i) XPS谱。j)LCM@Cap在pH 5.5和pH 7.4条件下Cu²⁺和Mn²⁺的累积释放曲线。

（2）纳米胶囊的靶向性能与体内成像评价

为实现主动肿瘤靶向，将HA偶联至LCM@Cap表面（记为HLCM@Cap），以结合肿瘤细胞过表达的CD44受体。细胞摄取实验表明，HLCM@Cap在4T1细胞中的摄取显著高于未修饰的LCM@Cap，流式细胞术（图2a）和荧光成像（图2b）均证实这一点，且纳米胶囊可被4T1细胞内化并逐渐从溶酶体中逃逸。体内IVIS成像显示，Cy5.5标记的HLCM@Cap荧光强度在约4 h达到峰值，并在注射后24 h（图2e）和48 h于肿瘤部位维持更强的荧光蓄积，表明其具有更优的肿瘤靶向特异性、蓄积效率和滞留时间；ICP-MS分析进一步证实HLCM@Cap组肿瘤内Cu蓄积显著更高，而肝脏Cu水平相对降低，提示靶向性增强且生物安全性改善。MR成像方面，含Mn的HLCM@Cap产生显著T1对比增强，且Mn²⁺浓度与纵向弛豫率（T1⁻¹）呈强线性关系（图2f-h）；pH 5.5条件下纵向弛豫率r1达21.70，显著高于中性条件下的8.89，这归因于酸性条件下纳米胶囊加速分解、促进Mn²⁺释放及活性位点暴露。活体MR成像显示，肿瘤区域T1信号在注射后约8 h达到峰值（图2j、k），晚于IVIS荧光峰值（4 h），这是因为MR对比增强依赖Mn²⁺的有效释放与水合这一耗时过程。Mn²⁺介导的T1加权成像可反映肿瘤内药物释放与蓄积，为优化αPD-L1给药时间窗以实现最大协同疗效给予初步指导。

图2. 纳米胶囊的靶向性能与体内成像评价。a) 流式细胞术分析4T1细胞对LCM@Cap和HLCM@Cap的摄取。b) 4T1细胞与FITC标记的LCM@Cap和HLCM@Cap孵育12 h后的代表性荧光图像，比例尺：50 μm。c) 静脉注射Cy5.5标记的BSA（对照）、LCM@Cap或HLCM@Cap前后4T1荷瘤小鼠的IVIS荧光图像，虚线圈表示肿瘤位置。d) 相对于0 h的肿瘤荧光强度平均变化。e) 注射后24 h主要脏器（心、肝、脾、肺、肾）和肿瘤的离体IVIS图像。f) 不同浓度纳米胶囊的T1加权MR成像。g) 相应的T1 mapping图像。h) 纵向弛豫率（T1⁻¹）随Mn²⁺浓度的变化。i) MR扫描实验设置示意图。j) 注射HLCM@Cap前后4T1荷瘤小鼠的体内T1加权MR图像，虚线圈表示肿瘤位置。k) 五只实验小鼠肿瘤区域相对T1信号强度的定量分析。

（3）HLCM@Cap增强铜死亡的效应及代谢调控机制

Western blot分析显示，HCu@Cap、HLC@Cap和HLCM@Cap组中铁硫簇蛋白ACO2、LIAS和FDX1显著下调（图3b、c），证实铜死亡被诱导；负载LF3和Mn²⁺的纳米胶囊（尤其是HLCM@Cap）较HCu@Cap引发更强的铜死亡反应，表明LF3介导的Wnt/β-catenin抑制与Mn辅助的信号调控可协同放大铜死亡效率。机制上，过量胞内铜顺利获得PDK1结合激活Wnt/β-catenin通路，同时破坏Fe-S簇蛋白、损害线粒体呼吸并驱动代偿性糖酵解重编程（图3a）。HCu@Cap组Wnt/β-catenin通路组分（β-catenin、p-AKT、Cyclin D1）、糖酵解标志物（HK2、LDHA、HIF-1α）及铜外排转运体ATP7B表达升高（图3d-g），表明铜外排与代谢可塑性被激活以缓解铜毒性。相比之下，含LF3的纳米胶囊（HLC@Cap和HLCM@Cap）有效抑制Wnt/β-catenin信号及Cyclin D1表达，下调ATP7B从而限制铜外排、维持胞内铜蓄积；同时LF3与Mn²⁺联合作用显著抑制糖酵解代谢，表现为糖酵解相关基因和蛋白表达降低、葡萄糖摄取减少、ATP生成下降及乳酸释放减少（图3h-j）。线粒体结构功能分析进一步证实：TEM显示HLCM@Cap组线粒体明显肿胀、膜电子密度增加、嵴模糊或断裂（图3k）；线粒体通透性转换孔（MPTP）活性显著增加（图3l）；JC-1染色显示线粒体膜电位明显下降（图3m）。上述结果表明，HLCM@Cap不仅诱导铜死亡，更从根本上破坏肿瘤细胞逃逸铜死亡的适应性反应，从而建立自放大的正反馈环路。

图3. HLCM@Cap增强铜死亡的效应。a) HLCM@Cap增强铜死亡机制的示意图。b) 铜死亡相关蛋白的Western blot分析。c) b)图中蛋白表达水平的定量分析。d) Wnt/β-catenin通路相关蛋白（ATP7B、β-catenin、p-AKT、Cyclin D1）的Western blot分析。e) 糖酵解通路相关蛋白（HK2、LDHA）的Western blot分析。f) ATP7B、β-catenin和Cyclin D1 mRNA表达水平的定量PCR分析。g) HK2和LDHA mRNA表达水平的定量PCR分析。h) 不同处理后细胞葡萄糖摄取（以2-DG6P生成量反映）的定量分析。i) 不同处理后细胞ATP生成的定量分析。j) 不同处理后乳酸生成的定量分析。k) 显示4T1细胞线粒体超微结构变化的代表性TEM图像。l) 不同处理后4T1细胞MPTP的荧光图像，比例尺：50 μm。m) JC-1荧光染色揭示不同处理后4T1细胞线粒体膜电位的变化，比例尺：50 μm。

（4）铜死亡顺利获得mtDNA释放协同激活cGAS-STING通路

HLCM@Cap诱导的铜死亡造成严重线粒体损伤与膜破裂，继而释放损伤mtDNA，被cGAS识别并激活STING通路（图4a）。8-OHdG与线粒体标志物TOMM20的免疫荧光共定位证实，大部分损伤DNA来源于线粒体（图4b）。SIM图像揭示了不同剂量HLCM@Cap刺激下线粒体的动态响应（图4c）：未处理细胞线粒体呈短杆状；低剂量处理诱导线粒体 elongation 与融合（适应性应激反应）；高剂量处理则导致线粒体进行性肿胀、嵴断裂、膜破裂及广泛mtDNA释放，最终线粒体空泡化，提示存在剂量依赖性的线粒体应激阈值。PCR和Western blot证实，mtDNA释放与纳米胶囊释放的Mn²⁺协同激活cGAS-STING信号：cGAS表达升高，p-TBK1、p-IRF3和p-STING磷酸化水平升高（图4d-h）；DNase I实验证实Mn²⁺介导的cGAS-STING激活主要顺利获得增强损伤DNA的传感敏感性实现。ELISA显示IFN-β（图4i）和TNF-α（图4j）分泌显著增加。cGAS-STING抑制剂H151实验表明，抑制该通路后糖酵解抑制和铜死亡诱导均显著减弱，证实cGAS-STING激活参与代谢调控并增强铜死亡敏感性，形成正反馈环路。转录组分析显示4474个显著差异基因（|log(FC)|≥1且Q<0.05），KEGG富集分析揭示胞质DNA传感、T细胞受体信号及PD-1/PD-L1免疫检查点通路的协同调控（图4l-n），为HLCM@Cap与免疫检查点阻断的协同给予了机制基础。

图4. 铜死亡顺利获得线粒体DNA释放协同激活cGAS-STING通路。a) 铜死亡介导cGAS-STING通路激活及后续免疫反应的示意图。b) 4T1细胞中氧化损伤DNA（8-OHdG，绿色）的免疫荧光染色，线粒体和细胞核分别用TOMM20（红色）和DAPI（蓝色）染色，比例尺：50 μm。c) SIM荧光图像显示4T1细胞内的mtDNA释放，比例尺：10 μm。d) cGAS-STING通路关键蛋白的Western blot分析。e-h) d)图中蛋白表达水平的定量分析。i, j) ELISA定量检测处理后24 h 4T1细胞分泌的IFN-β i)和TNF-α j)。k) H-151处理后铜死亡和糖酵解相关关键蛋白的表达。l) HLCM@Cap组与对照组差异基因的火山图。m) 差异基因的KEGG通路富集分析。n) 差异基因的热图分析。

（5）HLCM@Cap激活cGAS-STING通路、诱导细胞损伤并促进BMDC成熟

SIM成像证实线粒体肿胀与活性氧（ROS）生成增强（图5a），流式细胞术显示胞内ROS峰明显右移（图5b、c），且释放的Cu/Mn离子顺利获得类Fenton反应进一步放大氧化应激，导致DNA损伤（图5d、e）和凋亡（图5f），共同诱导ICD。肿瘤细胞表面钙网蛋白（CRT）显著暴露（图5g、h），HMGB1从核内转位至胞质（图5i），胞内ATP下降而胞外ATP释放增加，GSEA亦证实抗原加工与呈递通路显著富集。进一步将金属-酚醛纳米胶囊处理的肿瘤细胞与骨髓来源树突状细胞（BMDC）共培养，流式细胞术显示HLCM@Cap组CD80⁺/CD86⁺DC比例显著增加（图5j、k），表明BMDC成熟增强，为后续适应性抗肿瘤免疫应答给予了支撑。

图5. HLCM@Cap激活cGAS-STING通路、诱导细胞损伤并促进BMDC成熟。a) MitoSOX Red检测的4T1细胞线粒体ROS荧光图像，比例尺：10 μm。b) DCFH-DA染色检测胞内ROS的流式细胞术代表图。c) 不同处理后胞内ROS水平的流式细胞术定量。d, e) 不同处理后4T1细胞γH2AX表达的代表性免疫荧光图像及相应定量分析，比例尺：50 μm。f) Annexin V-FITC/PI染色分析凋亡的流式细胞术代表图。g, h) 不同处理后CRT暴露的代表性免疫荧光图像及定量分析，比例尺：50 μm。i) 不同处理后4T1细胞HMGB1的代表性免疫荧光图像，比例尺：50 μm。j) BMDC与HLCM@Cap处理的4T1细胞共培养示意图。k) 共培养后BMDC成熟的流式细胞术分析。

（6）体内协同抗肿瘤疗效

在4T1三阴性乳腺癌（TNBC）荷瘤小鼠模型中，依据MR成像提示的8–24 h肿瘤内纳米胶囊有效蓄积与释放窗口，制定给药方案：纳米胶囊于第1、4、7、10天静脉注射（5 mg/kg），αPD-L1于第2、5、8、11天腹腔注射（10 mg/kg）。动态监测显示（图6b、c），对照组肿瘤快速进展；HMn@Cap和HCu@Cap组表现出中等抑瘤作用；HLC@Cap和HLCM@Cap组抗肿瘤效果显著增强；HLCM@Cap⁺αPD-L1组抑瘤作用最强。实验终点时，对照组、HMn@Cap、HCu@Cap、HLC@Cap、HLCM@Cap和HLCM@Cap+αPD-L1组的肿瘤体积分别为1210.28±185.50、1054.76±170.16、743.40±97.16、354.10±97.26、250.38±48.54和122.68±43.48 mm³；肿瘤重量分别为1.14±0.15、0.97±0.10、0.88±0.07、0.65±0.09、0.56±0.07和0.30±0.09 g（图6d）。组织病理学分析显示，HLCM@Cap及联合组肿瘤坏死显著，TUNEL阳性凋亡细胞增加、Ki67阳性增殖细胞减少（图6e、g、h）；铁硫簇蛋白LIAS（铜死亡关键标志物）的表达在HCu@Cap、HLC@Cap和HLCM@Cap组中逐级递减（图6f、i），证实各组分间的协同效应。安全性评估方面，血清炎症因子、肝肾功能指标、体重及主要脏器H&E染色均未见明显异常，血铜锰水平及粪便铜排泄显示良好的代谢清除特性，确认其良好的生物相容性。

图6. 不同处理的体内抗肿瘤疗效。a) 评价抗肿瘤疗效的实验设计示意图。b) 各组剥离肿瘤的代表性照片。c, d) 不同处理后肿瘤体积生长曲线 c)和肿瘤重量 d)（n = 5）。e) 肿瘤组织切片的H&E、TUNEL和Ki67染色代表性图像，比例尺：100 μm。f) 肿瘤组织中LIAS的免疫荧光染色，比例尺：1 mm。g-i) TUNEL g)、Ki67 h)和LIAS i)表达的定量分析。

（7）HLCM@Cap联合αPD-L1重塑肿瘤免疫微环境

肿瘤组织学分析证实ICD有效诱导（CRT暴露增加，图7b），p-STING水平显著升高，且HLCM@Cap联合αPD-L1在所有处理组中激活免疫相关指标最强。流式细胞术分析显示，HLCM@Cap（尤其联合αPD-L1）显著增加肿瘤及肿瘤引流淋巴结中成熟DC比例；肿瘤内CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞浸润显著增加（图7c、d），免疫抑制性调节性T细胞（Treg，CD25⁺Foxp3⁺）比例明显降低（图7e、f），髓源性抑制细胞（MDSCs，CD11b⁺Ly6G⁺）亦呈下降趋势（图7g、h）。上述结果表明HLCM@Cap顺利获得诱导ICD和激活cGAS-STING信号，有效重塑肿瘤免疫微环境，将免疫学"冷"肿瘤转化为"热"肿瘤，从而增敏αPD-L1免疫治疗。免疫记忆评估显示，HLCM@Cap（联合αPD-L1更明显）显著增加肿瘤内CD8⁺效应记忆T细胞（Tem，CD44⁺CD62L⁻）和脾脏中CD8+中央记忆T细胞（Tcm，CD44⁺CD62L⁺）比例，为长期抗复发抗转移给予保护。

图7. HLCM@Cap联合αPD-L1阻断诱导体内免疫激活。a) 肿瘤ICD诱导cGAS-STING通路激活及后续免疫反应的示意图。b) 肿瘤组织中CRT的免疫荧光染色和p-STING的免疫组化染色，比例尺：100 μm。c) 4T1肿瘤组织中肿瘤浸润CD8⁺T细胞的流式细胞术代表图。d) 4T1肿瘤中肿瘤浸润CD8⁺T细胞的定量分析。e) 4T1肿瘤组织中Treg细胞（CD25⁺Foxp3⁺）的流式细胞术代表图。f) 4T1肿瘤中肿瘤浸润Treg细胞的定量分析。g) 4T1肿瘤组织中MDSCs（CD11b⁺Ly6G⁺）的流式细胞术代表图。h) 4T1肿瘤中肿瘤浸润MDSCs的定量分析。

（8）体内抑制肿瘤转移

在4T1肺转移模型中（观察期延长至30天），联合治疗组肺表面转移结节数量（3.8±2.05）显著少于对照组（68.0±7.25）、αPD-L1单药组（37.4±7.40）和HLCM@Cap单药组（17.2±4.15），且结节体积更小（图8b、c）；生存曲线显示联合治疗显著延长小鼠生存期（图8d）。这表明HLCM@Cap联合αPD-L1可有效抑制转移进展，其机制可能与增强的全身抗肿瘤免疫及持久免疫记忆的建立相关。

图8. 体内抗肿瘤转移效应。a) 评估体内肺转移形成抑制效果的实验方案示意图。b) 肺转移结节的代表性照片及肺转移灶的全景和放大H&E染色图像，比例尺：500 μm。c) 肺转移性肿瘤结节数量的定量分析（n = 5）。d) 接受不同处理小鼠的生存曲线。