K8·凯发(中国)

针对上述问题，北京大学口腔医院王晓燕教授、韩冰教授与中国科研实验室大学屈小中教授等团队构建了一种具有原位注射、湿黏附和层级功能化特点的双层水凝胶，用于牙周组织再生。该水凝胶由模拟牙槽骨和牙周膜微环境的PCAC和PCMC两层组成，顺利获得增强界面结合提高结构稳定性，并在不同区域分别负载miRNA-26a脂质体和PDGF-BB模拟肽，实现对骨形成和牙周膜纤维重建的时空调控。体内外实验表明，该双层水凝胶能够促进牙槽骨再生、诱导牙周膜胶原纤维有序排列，并形成类似Sharpey纤维的骨-牙周膜连接结构，实现牙周组织的功能性修复。该文章于2026年9月22日以《A Tightly Interlayer Bonded, Synchronously In Situ Co-Injectable, Wet-Adhesive, Hierarchically Biofunctionalized Bilayer Hydrogel for Functional Attachment and Orderly Periodontal Regeneration》为题发表于《Advanced Materials》（DOI: 10.1002/adma.75042）。

示意图1. 原位注射、分级生物功能化、湿粘附双层水凝胶（Bio-Fun双层水凝胶）用于功能性附着和有序一体化牙周再生的示意图。（A）可注射双层水凝胶的制备与分级生物功能化。（B）Bio-Fun双层水凝胶修复牙周缺损的应用及其层间键合与湿粘附原理，以及促进牙槽骨和牙周膜再生的机制。

（1）原位成型可注射双层水凝胶（PCMC/PCAC）的制备与表征

为构建具有层级结构的双层水凝胶体系，对Alg-MAL的化学修饰及PCAC/PCMC水凝胶的结构特征进行了表征。FTIR和¹H NMR结果证实Alg经马来酰亚胺功能化修饰，成功取得Alg-MAL（图1B、C）。基于动态硼酸酯键和Ca²⁺离子交联作用，分别制备了PCAC和PCMC水凝胶，并进一步顺利获得双通道注射实现双层水凝胶的原位构建（图1D、M）。SEM和AFM分析显示，两种水凝胶均具有多孔结构和相似的表面形貌（图1E、F）。力学性能测试表明，PCMC水凝胶具有较高的压缩和拉伸模量，而PCAC水凝胶表现出适用于成骨微环境的力学特征（图1G、H）。流变学分析显示，两种水凝胶均具有稳定的凝胶网络结构，储能模量高于损耗模量（图1I–L）。荧光成像进一步验证了双层水凝胶的分层结构及界面完整性（图1N）。上述结果表明，PCAC/PCMC双层水凝胶具备稳定的结构特征和可调控的力学性能，为后续牙周组织层级再生给予材料基础。

图1. 可注射湿黏附双层水凝胶的制备与表征。（A）Alg-MAL的合成示意图；（B）Alg和Alg-MAL的FTIR光谱；（C）Alg和Alg-MAL的¹H NMR光谱；（D）PCAC和PCMC水凝胶形成示意图；（E）PCAC和PCMC水凝胶的SEM图像；（F）水凝胶表面AFM图像；（G，H）水凝胶的压缩和拉伸性能；（I–L）水凝胶流变性能分析；（M）双通道注射器同步制备双层水凝胶；（N）双层水凝胶的荧光成像。

（2）PCAC与PCMC水凝胶的湿附着力性能及层间结合

对PCAC和PCMC水凝胶的湿黏附性能及双层界面结合能力进行了评价。黏附测试结果显示，PCAC和PCMC水凝胶均可与不同生物组织表面形成稳定结合，在牙齿和骨组织表面表现出较高的黏附强度（图2A–D）。在动态表面测试中，水凝胶仍保持良好的黏附稳定性（图2E）。双层水凝胶剥离实验表明，其界面结合强度高于材料内部凝聚强度，断裂主要发生于水凝胶本体而非双层界面，未出现明显界面脱层现象（图2F）。力-位移曲线分析显示，双层水凝胶具有稳定的机械结合性能（图2G）。上述结果表明，PCAC/PCMC双层水凝胶具备良好的湿环境黏附能力和界面稳定性。

图2. 双层水凝胶的湿黏附性能及界面结合能力。（A）PCAC和PCMC水凝胶与不同组织表面的黏附机制示意图；（B）水凝胶黏附性能测试示意图；（C，D）水凝胶在不同生物组织表面的黏附强度；（E）水凝胶在动态表面的黏附性能；（F）双层水凝胶界面剥离测试；（G）不同水凝胶结构的力-位移曲线。

（3）可注射双层水凝胶（PCMC@PDGF肽/PCAC@脂质体-miR26a）的空间时间生物功能化

对双层水凝胶的生物功能化组分及释放行为进行了表征。TEM和粒径分析显示，Lipo-miR26a保持类球形脂质体结构，粒径约为100 nm，miR26a负载后粒径略有增加；电位分析表明，miR26a负载后脂质体仍保持正电性（图3B–D）。细胞摄取实验显示，脂质体递送可提高miR26a的细胞内转运效率（图3E）。顺利获得巯基-马来酰亚胺点击反应将PDGF-BB模拟肽连接至Alg-MAL网络，FTIR结果验证了肽分子的成功偶联（图3F、G）。释放实验表明，Lipo-miR26a在水凝胶中呈持续释放行为，而共价结合的PDGF-BB模拟肽表现出较缓慢释放特征（图3H、I）。荧光成像显示，miR26a脂质体和PDGF-BB模拟肽可分别定位于双层水凝胶对应区域，实现功能分子的空间分布（图3J）。上述结果表明，双层水凝胶能够实现不同生物活性因子的区域化负载及可控释放。

图3. 双层水凝胶的层级生物功能化设计及释放行为。（A）PCAC@Lipo-miR26a和PCMC@PDGF Peptide功能化水凝胶构建示意图；（B）Lipo和Lipo-miR26a的TEM图像；（C，D）脂质体粒径及表面电位分析；（E）FAM-miR26a细胞摄取情况；（F）PDGF-BB模拟肽与Alg-MAL偶联示意图；（G）偶联前后FTIR分析；（H，I）miR26a和模拟肽的释放曲线；（J）功能分子在双层水凝胶中的空间分布。

（4）PCAC@Lipo-miR26a水凝胶对人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）分化的影响

实验评价了PCAC@Lipo-miR26a水凝胶对hBMSCs成骨分化的影响。细胞活性检测结果显示，PCAC@Lipo-miR26a水凝胶具有良好的细胞相容性（图4B、C）。成骨诱导实验中，PCAC@Lipo-miR26a组表现出更高的ALP活性和钙结节沉积水平（图4D、E）。RT-qPCR分析显示，该处理促进成骨相关基因RUNX2和OPN表达上调（图4F、G）。免疫荧光染色进一步验证了RUNX2和OPN蛋白表达增强（图4H–K）。上述结果表明，PCAC@Lipo-miR26a水凝胶能够促进hBMSCs成骨分化，为牙槽骨再生给予生物调控作用。

图4. PCAC@Lipo-miR26a水凝胶促进骨髓间充质干细胞成骨分化。（A）PCAC@Lipo-miR26a促进hBMSCs成骨分化示意图；（B，C）水凝胶对hBMSCs活性影响；（D，E）ALP和茜素红染色分析；（F，G）成骨相关基因RUNX2和OPN表达；（H–K）RUNX2和OPN免疫荧光染色及定量分析。

（5）PCMC@PDGF肽水凝胶对hPDLCs增殖、迁移及成纤维分化的影响

实验评价了PCMC@PDGF Peptide水凝胶对人牙周膜细胞（hPDLCs）功能调控的作用。不同浓度PDGF-BB模拟肽处理后，细胞增殖和迁移能力呈浓度依赖性变化，其中10 μg/mL表现出较好的促进效果（图5B–E）。PCMC@PDGF Peptide水凝胶提取液对hPDLCs无明显细胞毒性，并促进细胞增殖及向水凝胶内部迁移（图5F–I）。RT-qPCR结果显示，PCMC@PDGF Peptide组中牙周膜纤维相关基因POSTN、PLAP1、TNC和TNN表达升高（图5J）。免疫荧光染色及ELISA检测进一步验证了POSTN和TNC蛋白表达增加（图5K–N）。上述结果表明，PCMC@PDGF Peptide水凝胶可促进hPDLCs迁移及纤维化相关分化，为牙周膜功能性再生给予调控作用。

图5. PCMC@PDGF Peptide水凝胶促进牙周膜细胞迁移及纤维化分化。（A）PCMC@PDGF Peptide调控hPDLCs功能示意图；（B，C）不同浓度PDGF-BB模拟肽对细胞迁移能力的影响；（D，E）划痕实验及迁移率分析；（F，G）水凝胶对hPDLCs活性影响；（H，I）三维水凝胶中细胞迁移及定量分析；（J）纤维化相关基因表达；（K–N）POSTN、TNC等蛋白表达及定量分析。

（6）用于体内肺泡骨和牙周韧带联合再生的时空生物功能化双层水凝胶（Bio-Fun双层）

在大鼠牙周缺损模型中评价Bio-Fun双层水凝胶对牙周组织综合再生的作用（图6A）。Micro-CT三维重建结果显示，各水凝胶处理组均不同程度促进缺损区域骨形成，其中Bio-Fun双层水凝胶组表现出陆续在性更高的新生骨填充效果（图6B）。定量分析结果显示，Bio-Fun双层水凝胶组的骨体积分数（BV/TV）和骨小梁数量（Tb.N）显著增加，骨小梁间距（Tb.Sp）降低，表明该体系可促进牙槽骨结构重建（图6C–E）。组织学分析显示，对照组缺损区域主要被软组织占据，未形成明显牙周膜样结构；普通双层水凝胶组仅观察到有限的新骨形成，而Bio-Fun双层水凝胶组出现更丰富的新生骨组织及较完整的牙周组织结构（图6F）。Masson染色进一步显示，Bio-Fun双层水凝胶组具有较多胶原沉积，并形成排列较为有序的牙周膜样纤维结构，同时伴随明显的新生血管形成（图6G）。此外，商业骨移植/膜材料组虽然促进了部分骨组织形成，但存在残留材料颗粒及组织整合不足现象，而Bio-Fun双层水凝胶组表现出更好的缺损区域填充和组织融合效果（图6F、G）。上述结果表明，Bio-Fun双层水凝胶能够协调促进牙槽骨形成、胶原纤维重建及血管生成，实现牙周软硬组织的综合再生。

图6. 双层功能化水凝胶促进牙周组织综合再生。（A）大鼠牙周缺损模型及治疗示意图；（B）不同处理组Micro-CT三维重建图像；（C–E）骨再生相关参数分析；（F，G）牙周缺损组织H&E和Masson染色分析。

（7）用于活体牙周韧带有序排列与功能附着的时空生物功能化双层水凝胶

在大鼠牙周缺损模型中进一步评价Bio-Fun双层水凝胶对牙周膜纤维形成及功能连接的影响。Sirius Red染色结果显示，Bio-Fun双层水凝胶组形成了明显的牙周膜样纤维结构，其中部分纤维一端连接新生牙骨质，另一端嵌入新生牙槽骨，呈现类似Sharpey纤维的连接模式，而其他处理组未观察到类似结构（图7A）。偏振光观察及胶原Ⅰ/Ⅲ免疫荧光染色结果显示，Bio-Fun双层水凝胶组胶原Ⅰ和胶原Ⅲ沉积水平明显增加，并接近天然牙周膜组织的胶原表达特征（图7B）。胶原定量分析进一步显示，该组胶原Ⅰ和胶原Ⅲ阳性区域面积均显著提高（图7C、D）。进一步对牙周膜纤维排列方向进行分析发现，Bio-Fun双层水凝胶组胶原纤维取向分布更加集中，呈现与天然牙周膜相似的有序排列模式，而对照组及其他处理组纤维分布较为紊乱（图7E–M）。上述结果表明，Bio-Fun双层水凝胶不仅促进牙周膜胶原形成，同时能够调控纤维空间排列，实现牙周膜结构化再生及功能性连接。

图7. 双层功能化水凝胶促进牙周膜纤维有序排列及功能连接。（A）Sirius Red染色观察牙周膜纤维形成；（B）偏振光及胶原Ⅰ/Ⅲ免疫荧光染色；（C，D）胶原Ⅰ和胶原Ⅲ定量分析；（E）牙周膜纤维排列示意图；（F–M）不同处理组胶原纤维取向分析。

（8）PCAC@Lipo-miR26a水凝胶促进成骨的体外与体内机制

为探究PCAC@Lipo-miR26a水凝胶促进牙槽骨再生的作用机制，对Wnt/β-catenin信号通路相关分子进行了检测（图8A）。RT-qPCR结果显示，PCAC@Lipo-miR26a处理后，hBMSCs中GSK3β表达降低，而β-catenin表达升高，提示miR26a可调控Wnt信号通路活化（图8B、C）。免疫荧光染色进一步显示，PCAC@Lipo-miR26a组β-catenin蛋白表达增强（图8D）。在大鼠牙周缺损组织中，免疫荧光分析显示，PCAC@Lipo-miR26a及Bio-Fun双层水凝胶组RUNX2和β-catenin表达水平高于对照组及未功能化水凝胶组，其中Bio-Fun双层水凝胶组两者表达及共定位水平最高（图8E–H）。上述结果表明，miRNA-26a负载水凝胶可顺利获得调控GSK3β/β-catenin信号轴促进成骨相关基因表达，并增强牙槽骨再生过程中的成骨分化。

图8. miR26a介导的成骨调控机制分析。（A）miR26a调控GSK3β/β-catenin/RUNX2信号通路示意图；（B，C）GSK3β和β-catenin基因表达分析；（D）β-catenin免疫荧光染色；（E–H）RUNX2和β-catenin免疫荧光染色及共定位分析。

（9）PCMC@PDGF肽水凝胶促进牙周韧带再生的体外与体内机制

为明确PDGF-BB模拟肽促进牙周膜再生的分子机制，对处理前后的hPDLCs进行转录组分析（图9A）。差异基因分析显示，PDGF-BB模拟肽处理后存在上调和下调的差异表达基因（图9A）。GO富集分析表明，差异基因主要涉及细胞迁移、生长及凋亡调控等生物过程（图9B、C）。KEGG通路分析显示，PI3K/Akt信号通路、ECM-受体相互作用、黏附斑及肌动蛋白骨架调控等通路显著富集（图9D）。进一步检测结果显示，PCMC@PDGF Peptide水凝胶处理后hPDLCs中PI3K和Akt相关基因表达升高（图9E、F）。差异表达基因热图显示，多种与细胞外基质重塑及纤维形成相关的基因发生改变，其中LOX、FGF和POSTN等基因表达上调（图9G）。RT-qPCR及免疫荧光结果验证了LOX表达水平的升高（图9H–J）。上述结果表明，PDGF-BB模拟肽调控hPDLCs基因表达谱，并可能顺利获得激活PI3K/Akt相关信号促进牙周膜纤维形成及基质重塑。

针对PI3K/Akt-LOX/POSTN信号轴对牙周膜功能性再生的调控作用进行检测（图10A–I）。免疫荧光染色结果显示，Bio-Fun双层水凝胶组PI3K表达水平升高，其阳性表达面积和荧光强度均高于其他处理组（图10A–C）。LOX和POSTN免疫荧光分析显示，Bio-Fun双层水凝胶组两种蛋白表达显著增强（图10D–H），提示细胞外基质重塑和胶原成熟过程受到促进。采用PI3K/Akt通路抑制剂LY294002进行验证的结果显示，PI3K/Akt信号抑制后POSTN和LOX表达水平下降，而联合PDGF-BB模拟肽处理可部分恢复相关蛋白表达（图10I）。上述结果表明，PDGF-BB模拟肽顺利获得激活PI3K/Akt信号通路调控POSTN/LOX轴，促进牙周膜细胞功能化分化及胶原纤维成熟，为牙周膜有序再生给予分子调控依据。

图9. PDGF-BB模拟肽调控牙周膜再生的转录组及功能分析。（A）差异表达基因分析；（B，C）GO功能富集分析；（D）KEGG通路富集分析；（E，F）PI3K和Akt表达分析；（G）差异基因热图；（H–J）LOX表达检测及免疫荧光分析。

图10. PDGF-BB模拟肽促进牙周膜功能性连接的作用机制。（A）PI3K和POSTN免疫荧光染色；（B，C）PI3K表达定量分析；（D）LOX和POSTN免疫荧光染色；（E–H）POSTN和LOX表达定量分析；（I）PDGF-BB模拟肽激活PI3K/Akt-LOX/POSTN信号促进牙周膜纤维形成的机制示意图。